Reducción de la infectividad del síndrome respiratorio agudo severo SarscoV-2 mediante la concentración admisible de gas ozono y agua

El coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo 2 (SARS-CoV-2) es un virus envuelto que pertenece a la familia Coronaviridae y tiene un ARN de cadena positiva como genoma. Surgió a finales de 2019 en Wuhan (China) y se extendió rápidamente por todo el mundo. Dado que el SARS-CoV-2 tiene una alta similitud de secuencia con algunos coronavirus de murciélagos, se supone que los murciélagos son el reservorio natural, y que se transmitió a los humanos a través de un huésped intermedio, como el pangolín. La infección por el SARS-CoV-2 provoca síntomas similares a los de la gripe, como fiebre, tos, dolor faríngeo y sensación de fatiga durante las primeras fases. Algunos pacientes también desarrollan neumonía, que puede evolucionar a un síndrome de dificultad respiratoria aguda y otras complicaciones graves. La enfermedad causada por el SARS-CoV-2 se conoce como enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19).

El mundo no ha experimentado una pandemia de este tipo desde hace aproximadamente 100 años, desde el brote de gripe española de 1918. Hasta el 14 de septiembre de 2020, 28,6 millones de personas se han infectado con el SARS-CoV-2 y 917.000 han muerto. El resultado de la infección por el SARS-CoV-2 varía según la edad, las condiciones de salud subyacentes, la disponibilidad de atención médica y la nacionalidad, y la tasa de mortalidad se estima en un 2-3%. La tasa de reproducción básica (R0) en Wuhan se informó de que era del 2-3,3 pero puede reducirse notablemente con las contramedidas adecuadas, como la ventilación del aire, el lavado de manos y la pulverización de etanol.

El ozono (O3) está compuesto por tres átomos de oxígeno. Está presente en 2-10 ppm en la capa de ozono de la estratosfera, y en <0,05 ppm cerca del suelo. El ozono es inestable y altamente reactivo, con una vida media de aproximadamente 1 hora en condiciones ambientales; además, oxida ciertas sustancias. El ozono es un fuerte oxidante que produce radicales hidroxilos en presencia de agua. Los radicales hidroxilos tienen el mayor poder oxidativo entre todas las especies reactivas del oxígeno, por lo que el efecto oxidativo del gas ozono es mayor en condiciones de humedad. El gas ozono y el agua se utilizan con frecuencia para desinfectar habitaciones (suelos, paredes, techos, muebles y aire), instrumentos, manos, aguas limpias y residuales y alimentos (verduras, frutas, pescado y carne). El ozono inactiva una variedad de microorganismos, como bacterias, hongos, parásitos y virus. El ozono daña las moléculas estructurales virales, como los lípidos de la envoltura, las glicoproteínas y las proteínas de la cápside, inactivando así el virus.

Dado que se desconoce el efecto del ozono sobre el SARS-CoV-2, evaluamos el efecto de dosis bajas de gas ozono sobre el SARS-CoV-2. El título infeccioso de SARS-CoV-2 disminuyó con el tiempo en presencia de 0,1 o 0,05 ppm de gas ozono. Asimismo, el agua con baja concentración de ozono redujo la infectividad del SARS-CoV-2. Por lo tanto, el ozono a una concentración no tóxica puede utilizarse para suprimir la transmisión del SARS-CoV-2.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cultivo celular y reactivos

Las células VeroE6/TMPRSS2 expresan el gen de la serina proteasa transmembrana 2 y se obtuvieron del Banco de Células de la Colección Japonesa de Recursos Biológicos de Investigación. Las células se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Nacalai-Tesque), complementado con un 5% de suero fetal bovino (FBS) y penicilina-estreptomicina (Sigma-Aldrich). El SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2/Hu/DP/Kng/19-020, aislado de una muestra de garganta de un paciente del crucero Diamond Princess) se obtuvo del Instituto de Salud Pública de la Prefectura de Kanagawa, Japón. El virus se amplificó infectando células VeroE6/TMPRSS2 en un frasco de cultivo de 175 cm2 en DMEM suplementado con 1% de FBS. Cuando el 100% de las células mostraron un efecto citopático, se cosechó el medio de cultivo, se centrifugó a baja velocidad y se filtró. El virus amplificado se tituló utilizando células VeroE6/TMPRSS2.

2.2 Administración de gas ozono/agua

Para la administración de gas ozono a una concentración constante predefinida, utilizamos un sofisticado sistema de regulación. Para el tratamiento con gas ozono, se colocaron un generador de gas ozono, un monitor de gas ozono y una sonda termohigrómetrica en un recipiente acrílico transparente. Como control, se utilizó un recipiente similar sin el generador de gas ozono. En función de la concentración de gas ozono, el sistema de control conectó y desconectó la alimentación del generador de gas para mantener una concentración de ozono constante. Se utilizó un depósito de agua para humedecer el aire del contenedor.

Se formaron discos de acero inoxidable de 2 cm de diámetro. Se dejó caer una solución de virus (50 μL) y se extendió sobre los soportes y se secó al aire. Se colocaron los portadores en los contenedores y se administró gas ozono en las condiciones indicadas. El virus se recogió suspendiendo los portadores en DMEM con un 2% de FBS (500 μL).

Se produjo agua con ozono utilizando el L CLEAN Minnie (Tamura TECO Co. Ltd), y la concentración se ensayó midiendo la absorbencia de la luz utilizando un colorímetro de ozono (C105; Eutech Instruments Co.). A continuación, se mezcló la solución de virus (1 μL) con agua de ozono (100 μL). Tras 10 s, se añadieron 899 μL de DMEM suplementado con 20% de FBS y se mezcló bien.

El medio que contenía el virus se diluyó en serie 10 veces con DMEM fresco que contenía 2% de FBS, y se dispensó en células VeroE6/TMPRSS2 en una placa de cultivo de 96 pocillos. La dosis infecciosa de cultivo tisular 50 (TCID50) se calculó a partir de la aparición de efectos citopáticos. Se realizaron dos o tres experimentos independientes para cada condición.

Para los experimentos con gas ozono, el valor de la concentración-tiempo (CT) se definió como la concentración de gas ozono (ppm) multiplicada por la duración de la administración (min). Las muestras de CT 60 se recogieron tras la incubación en el contenedor de tratamiento de ozono durante 10 y 20 horas, para las condiciones de gas ozono de 0,1 y 0,05 ppm, respectivamente. Las muestras de CT 0 se incubaron en el contenedor de control durante 10 y 20 horas para las condiciones de gas ozono de 0,1 y 0,05 ppm, respectivamente. Para las muestras CT 24, el SARS-CoV-2 se incubó en el contenedor de gas ozono durante 4 y 8 horas, para 0,1 y 0,05 ppm, respectivamente, y luego se transfirió al contenedor de control para el resto del experimento. Asimismo, las muestras de CT 42 se incubaron con gas ozono durante 7 y 14 horas, para 0,1 y 0,05 ppm, respectivamente, y luego se asentaron en el contenedor de control durante el resto del tiempo.

3 RESULTADOS

Tratamiento con gas ozono

En primer lugar, administramos gas ozono a 0,1 ppm, que es la concentración permitida para los seres humanos definida por la Sociedad Japonesa de Salud Laboral. Se colocó un depósito de agua en ambos contenedores para humedecer el aire. El tratamiento con gas ozono se inició cuando la humedad alcanzó el 75%. La humedad media fue de aproximadamente el 80%. Cuando el valor del TC alcanzó 24 (4 horas), la infectividad del SARS-CoV-2 disminuyó en un 73,2% en comparación con el control. El virus se inactivó en un 86,7% y un 95,4% a los TC 42 y 60, respectivamente. A continuación, evaluamos el gas ozono de 0,05 ppm, la concentración máxima tolerada según la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos, en condiciones de humedad. Encontramos reducciones del 60,9%, 82,4% y 94,3% en el título de SARS-CoV-2 en los TC 24, 42 y 60, respectivamente.